IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) යනු β-galactosidase උපස්ථරයේ ප්‍රතිසමයක් වන අතර එය බෙහෙවින් ප්‍රේරණය වේ.IPTG ප්‍රේරණය යටතේ, ප්‍රේරකයට ප්රේරක ප්රෝටීන් සමඟ සංකීර්ණයක් සෑදිය හැක, එවිට ප්‍රතිරෝධක ප්‍රෝටීනයේ අනුකූලතාව වෙනස් වන අතර එමඟින් ඉලක්කගත ජානය සමඟ ඒකාබද්ධ කළ නොහැකි අතර ඉලක්කගත ජානය කාර්යක්ෂමව ප්‍රකාශ වේ.එසේනම් අත්හදා බැලීමේදී IPTG සාන්ද්රණය තීරණය කළ යුත්තේ කෙසේද?ලොකු එක හොඳද?
පළමුව, අපි IPTG ප්‍රේරණයේ මූලධර්මය තේරුම් ගනිමු: E. coli හි ලැක්ටෝස් ඔපෙරෝන් (මූලද්‍රව්‍ය) හි ව්‍යුහාත්මක ජාන තුනක් අඩංගු වේ, Z,Y සහ A, පිළිවෙලින් β-galactosidase, permease සහ acetyltransferase සංකේතනය කරයි.lacZ ලැක්ටෝස් ග්ලූකෝස් සහ ග්ලැක්ටෝස් බවට හෝ ඇලෝ-ලැක්ටෝස් බවට ජල විච්ඡේදනය කරයි;lacY පරිසරයේ ඇති ලැක්ටෝස් සෛල පටලය හරහා ගමන් කිරීමට සහ සෛලයට ඇතුල් වීමට ඉඩ සලසයි;lacA ඇසිටයිල් කාණ්ඩය ඇසිටයිල්-CoA සිට β-ගැලැක්ටොසයිඩ් වෙත මාරු කරයි, එයට විෂ සහිත බලපෑම ඉවත් කිරීම ඇතුළත් වේ.මීට අමතරව, O මෙහෙයුම් අනුක්‍රමයක්, ආරම්භක අනුක්‍රමයක් P සහ නියාමන ජාන I ද ඇත. I ජාන කේතය යනු ක්‍රියාකරු අනුපිළිවෙලෙහි O ස්ථානයට බැඳිය හැකි ප්‍රතිප්‍රොaටන ප්‍රෝටීනයකි, එවිට ඔපෙරෝනය (මෙටා) මර්දනය වේ. අක්රිය කළා.කැටබොලික් ජාන සක්‍රියකාරක ප්රෝටීන්-CAP බන්ධන අඩවිය සඳහා බන්ධන අඩවියක් ද ඇත. P. අනුක්‍රමය, O අනුක්‍රමය සහ CAP බන්ධන අඩවිය එක්ව lac operon හි නියාමන කලාපය සාදයි.ජාන නිෂ්පාදනවල සම්බන්ධීකරණ ප්‍රකාශනය සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා එන්සයිම තුනේ කේතීකරණ ජාන එකම නියාමන කලාපයක් මගින් නියාමනය කරනු ලැබේ.
ලැක්ටෝස් නොමැති විට, ලැක් ඔපෙරෝන් (මෙටා) මර්දනය කිරීමේ තත්වයක පවතී.මෙම අවස්ථාවේදී, PI ප්‍රවර්ධක අනුක්‍රමයේ පාලනය යටතේ I අනුක්‍රමය මගින් ප්රකාශිත lac repressor O අනුක්‍රමයට බන්ධනය වේ, එය RNA පොලිමරේස් P අනුපිළිවෙලට බන්ධනය වීම වළක්වන අතර පිටපත් කිරීමේ ආරම්භය වළක්වයි;ලැක්ටෝස් පවතින විට, ලැක් ඔපෙරෝන් (මෙටා) ප්‍රේරණය කළ හැක මෙම ඔපෙරෝන් (මෙටා) පද්ධතියේ සැබෑ ප්‍රේරකය ලැක්ටෝස් නොවේ.ලැක්ටෝස් සෛලයට ඇතුළු වන අතර ඇලෝලැක්ටෝස් බවට පරිවර්තනය කිරීම සඳහා β-ග්ලැක්ටොසිඩේස් මගින් උත්ප්‍රේරණය වේ.දෙවැන්න, ප්රේරක අණුවක් ලෙස, ප්‍රතිරෝධක ප්‍රෝටීනයට බන්ධනය වන අතර ප්රෝටීන් අනුකූලතාව වෙනස් කරයි, එය O අනුපිළිවෙලින් සහ පිටපත් කිරීමෙන් ප්‍රතිරෝධක ප්රෝටීන් විඝටනය වීමට හේතු වේ.Isopropylthiogalactoside (IPTG) ඇලෝලැක්ටෝස් වලට සමාන බලපෑමක් ඇති කරයි.එය ඉතා බලගතු ප්‍රේරකයක් වන අතර එය බැක්ටීරියා මගින් පරිවෘත්තීය නොවන අතර ඉතා ස්ථායී වේ, එබැවින් එය රසායනාගාරවල බහුලව භාවිතා වේ.
IPTG හි ප්රශස්ත සාන්ද්රණය තීරණය කරන්නේ කෙසේද?උදාහරණයක් ලෙස E. coli ගන්න.
ධනාත්මක ප්‍රතිසංයෝජන pGEX (CGRP/msCT) අඩංගු E. coli BL21 ජානමය වශයෙන් නිර්මාණය කරන ලද වික්‍රියාව 50μg·mL-1 Amp අඩංගු LB ද්‍රව මාධ්‍යයට එන්නත් කරන ලද අතර 37°C දී එක රැයකින් වගා කරන ලදී.ඉහත සංස්කෘතිය ප්‍රසාරණ සංස්කෘතිය සඳහා 1:100 අනුපාතයකින් 50μg·mL-1 Amp අඩංගු 50mL නැවුම් LB දියර මාධ්‍ය බෝතල් 10කට එන්නත් කරන ලද අතර OD600 අගය 0.6~0.8 වූ විට අවසාන සාන්ද්‍රණයට IPTG එකතු කරන ලදී.එය 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 වේ.එම උෂ්ණත්වයේ දී සහ එම අවස්ථාවේදීම ප්‍රේරණය කිරීමෙන් පසු, බැක්ටීරියා ද්‍රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 1 ක් එයින් ලබා ගත් අතර, බැක්ටීරියා සෛල කේන්ද්‍රාපසාරී මගින් එකතු කර ප්රෝටීන් ප්‍රකාශනයට විවිධ IPTG සාන්ද්‍රණයන්හි බලපෑම විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා SDS-PAGE වෙත යවා, පසුව විශාලතම ප්රෝටීන් ප්‍රකාශනය සහිත IPTG සාන්ද්රණය තෝරන්න.
අත්හදා බැලීම්වලින් පසුව, IPTG සාන්ද්රණය හැකි තරම් විශාල නොවන බව සොයා ගනු ඇත.මෙයට හේතුව IPTG බැක්ටීරියා වලට යම් විෂ සහිත වීමයි.සාන්ද්රණය ඉක්මවා යාමෙන් සෛලය ද විනාශ වේ;සහ සාමාන්යයෙන් කථා කරන විට, සෛලය තුළ ප්රකාශිත වඩා ද්රාව්ය ප්‍රෝටීනය වඩා හොඳ යැයි අපි බලාපොරොත්තු වෙමු, නමුත් බොහෝ අවස්ථාවන්හිදී IPTG සාන්ද්රණය ඉතා ඉහළ මට්ටමක පවතින විට, ඇතුළත් කිරීම් විශාල ප්‍රමාණයක් සෑදෙනු ඇත.ශරීරය, නමුත් ද්රාව්ය ප්රෝටීන් ප්රමාණය අඩු විය.එමනිසා, වඩාත් සුදුසු IPTG සාන්ද්රණය බොහෝ විට විශාල වන තරමට වඩා හොඳ නොවේ, නමුත් සාන්ද්රණය අඩු වේ.
ජානමය වශයෙන් සකස් කරන ලද වික්‍රියා ප්‍රේරණය කිරීමේ සහ වගා කිරීමේ අරමුණ වන්නේ ඉලක්කගත ප්රෝටීන් අස්වැන්න වැඩි කිරීම සහ පිරිවැය අඩු කිරීමයි.ඉලක්කගත ජානයේ ප්‍රකාශනය වික්‍රියා වල ස්වකීය සාධක සහ ප්ලාස්මිඩ් ප්‍රකාශනය මගින් පමණක් නොව, ප්‍රේරකයේ සාන්ද්රණය, ප්රේරක උෂ්ණත්වය සහ ප්‍රේරණ කාලය වැනි වෙනත් බාහිර තත්වයන් මගින් ද බලපායි.එබැවින්, සාමාන්යයෙන්, නොදන්නා ප්රෝටීනයක් ප්රකාශිත හා පවිත්ර කිරීමට පෙර, සුදුසු තත්වයන් තෝරාගැනීම සහ හොඳම පර්යේෂණාත්මක ප්රතිඵල ලබා ගැනීම සඳහා ප්රේරක කාලය, උෂ්ණත්වය සහ IPTG සාන්ද්රණය අධ්යයනය කිරීම වඩාත් සුදුසුය.
පසු කාලය: දෙසැම්බර්-31-2021